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FUL-ARMS 2x PCR Mix 说明书
I. 试剂盒货号
名称： | 货号 | 规格 | 保存方式 |
FLU-ARMS 2X PCR mix：
包含TjTaq、dNTP、Mg2 、探针、Buffer等. | BGH1001 | FLU-ARMS 2X mix 96/384, 500x10ul reactions(2.5ml) | -20°C 至少保存12个月，避免反复冻融 |
BGH1025 | FLU-ARMS 2X mix 96/384, 5,000x10ul reactions(25ml) | -20°C 至少保存12个月，避免反复冻融 | |
BGH1250 | FLU-ARMS 2X mix 96/384, 50,000x10ul reactions(250ml) | -20°C 至少保存12个月，避免反复冻融 |
II. KASP基因分型原理
FLU-ARMS这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。和Kompetitive Allele-Specific PCR(KASP)完全兼容
实验流程主要包括：
• 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物PCR Mix；3）DNA 模板
• PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
图1 KASP检测原理
III. 产品特点
1. 2x预混型反应试剂，包含SNP 分型所需组分，仅需加入DNA模板与引物即能开始反应。
2. 经久测试、优化，保存及工作性能稳定。
3. 组分预混，省时省事，极大降低污染可能性。
IV. 注意事项
1. 为了提高分型成功率，上游分型引物终浓度应≤200nM；
2. 注意避光保存。
3. 为保证使用效果，试剂盒保存于-20 °C，避免长期放置于4°C 或室温条件下。
4. 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀，避免产生泡沫，短暂离心后备用。
5. 尽量使用无菌的蒸馏水。
V. 实验步骤
1. 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。
2. 按照下表内容，在冰上准备 PCR反应液。
添加组分 | 加量（10μl 体系） |
DNA Template | 50 ng – 100 ng |
Kasp 2x PCR Mix | 5 μl |
上游分型引物F1（10μM） | 0.2 μL |
上游分型引物F2（10μM） | 0.2 μL |
下游通用引物R（10μM） | 0.4 μL |
补水至10 μL | |
3. PCR反应条件
step 1 | 预变性 | 94℃ | 15 min | 1 循环 |
step 2 | 降落PCR | 94℃ | 5 s | 9 循环 |
63.4→57℃ -0.8℃/循环 | 15 s | |||
step 3 | 扩增 | 94℃ | 5 s | 35 循环 |
57.5℃ | 15 s | |||
step 4 | 读板 | 16℃ | 20 s （read） | 2 循环 |
VI. FAQ
建议的PCR反应体系是怎样的？
96孔板，10µL 体系，其中2µl DNA（DNA浓度25~50ng/ul）， 5µL mix, 0.14 µL引物，补水至10ul。
384孔板，5µL体系，其中1µl DNA （DNA浓度25~50ng/ul）， 2.5 µL mix, 0.07µL引物，补水至10ul。
FUL-ARMS技术对DNA的要求？
建议最小的DNA浓度为2.5 ng / µL。
不同基因组大小所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。
建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。
粗提的DNA即可满足实验需求，请尽量保证DNA浓度的一致性,
提取DNA尽量不要用到EDTA。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl2优化。
NTC信号值高的原因？
NTC被DNA样品污染
循环数太多，引物 自身扩增。建议多加几个NTC
引物设计问题，扩增产物中有引物二聚体存在， 建议重新设计引物。
FLU-ARMS 试剂的储存条件及建议是什么？
FLU-ARMS 引物及 PCR mix 可在4度保存一周，建议储存在-20度/-80度，
避光保存， 避免反复冻融（尽量冻融不要超过3次）